晶欣 重組人纖粘連蛋白片段 轉染 *   產品貨號：GX100B 

儲存條件：-20℃

產品組分：重組人纖粘連蛋白 2.5mg，該試劑以1 mg/ml 溶液形式提供。【含有12.5 mM檸檬酸鈉(pH 6.2)和1.25%蔗糖的無菌溶液。】

產品介紹：

該重組人纖維連接片段（rFN-CH-296），由三個功能結構域組成：細胞結合域 、肝磷脂結合域和CS1位點。該片段通過協助靶細胞和病毒粒子的共定位來增強逆轉錄病毒介導的基因轉導。其作用原理是：逆轉錄病毒載體與肝磷脂結合域結合，細胞表面VLA-5及 VLA-4分別與該纖連蛋白的細胞結合域 和 CS-1位點結合。

在經重組人纖粘連蛋白片段包被的培養容器表面，細胞與病毒載體高濃度共存，從而提高基因感染效率。

感染方案：

1.逆轉錄病毒與該重組人纖粘連蛋白片段包被的培養板結合，去除逆轉錄病毒上清液后加入靶細胞。但去除上清液會減少抑制性分子(例如，從生產細胞分泌的分子，如蛋白聚糖、病毒包膜蛋白)，從而降低病毒介導的基因轉導效率。

2.細胞與病毒上清液混合并結合到重組人纖粘連蛋白片段包被的培養板上。

兩種方案均可用于有效的基因轉導。盡管方案1廣泛適用，但具體實驗方案可能仍需根據靶細胞、載體、靶基因進行修改。

晶欣 重組人纖粘連蛋白片段 轉染 *   產品貨號：GX100B 

實驗方案：

1. 重組人纖粘連蛋白片段包被培養板的制備

將重組人纖粘連蛋白片段包被于培養板上，濃度20-100μg/ml的重組人纖粘連蛋白片段可達到4-20μg/cm²的包被密度。

（1）包被前，用無菌PBS將該溶液稀釋至20-100μg/ml。【請提前計算重組人纖粘連蛋白試劑的用量，如：2.25ml濃度為20μg/ml的重組人纖粘連蛋白溶液放入直徑為35mm的培養皿（9cm²）中時，用于包被的密度為5μg/cm²】

注意：為避免重組人纖粘連蛋白片段丟失，請勿將PBS稀釋的重組人纖粘連蛋白溶液過濾除菌。

（2）將適當體積（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml。）的無菌重組人纖粘連蛋白溶液分配到每個板中，讓板在室溫下靜置2小時或在4℃過夜。

注意:在此步驟中應使用未經處理的細胞培養級組織培養板或培養皿。

（3）移除重組人纖粘連蛋白溶液，然后用適量含無菌2%牛血清白蛋白(BSA，Fraction V)的PBS溶液進行封閉（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml），讓板在室溫下靜置30分鐘。

（4）移除BSA溶液，用適當體積的HBSS/Hepes或PBS清洗一次。除去洗滌液后，即可使用。重組人纖粘連蛋白片段包被板可用封板膜密封，并在4℃下儲存—周。

2.基因轉導

使用重組人纖粘連蛋白試劑進行基因轉導的方法有兩種:重組人纖粘連蛋白結合病毒感染法(A方法)和上清液感染法(B方法)。在A方法中，逆轉錄病毒顆粒首先結合到涂有重組人纖粘連蛋白試劑的板上，去除病毒上清液后加入靶細胞。在B方法中，將病毒溶液和靶細胞混合，然后添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中。

如果病毒溶液未經純化直接用于病毒感染，可能會因為污染導致基因轉導效率降低。在這種情況下，推薦使用A方法，通過將病毒與重組人纖粘連蛋白試劑結合并去除上清液來去除抑制物。

A.重組人纖粘連蛋白結合病毒感染方法

A-1.病毒結合板制備（無需離心）

1.將125- 250μl/cm2的逆轉錄病毒上清液添加到涂有重組人纖粘連蛋白的培養板或培養皿中。

2.在5% CO2培養箱中 32℃或37℃孵育4至6小時，使病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白試劑充分結合。

3.棄上清液，但不要讓培板干燥。用適當體積的 PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的 PBS清洗，清洗后按A-3進行感染。

A-2.離心法制備病毒結合板

如果病毒滴度足夠高，則病毒與重組人纖粘連蛋白試劑的結合無需離心即可完成，如A-1中所述。

但如果滴度較低，或者您需要更高的基因轉導效率，則最好通過離心結合病毒。使用這種方法，結合逆轉錄病毒所需的時間顯著減少(離心法2小時，非離心法4-6小時)。一塊未經處理的細胞培養板，在32℃下可以承受1,000-2,000g離心2小時。此外，請注意有可能形成氣溶膠。

1.將125-500μl/cm²的逆轉錄病毒原液或稀釋溶液添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中。

2.將板置于預熱至32℃的離心機中，并在32℃ 1,000-2,000g 下離心2小時，以使病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白試劑充分結合。

3.棄上清液，但不要讓板干燥。用適當體積的PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的PBS清洗，然后按照A-3進行病毒感染。

A-3.病毒感染

在逆轉錄病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白片段包被板結合時準備靶細胞。靶細胞處于對數生長期并表達整合素受體VLA-4和/或VLA-5至關重要。當使用造血干細胞時，可能需要用細胞因子進行預刺激，細胞因子類型應根據您的具體研究方案確定。

1.收集目標細胞并計算活細胞的數量，然后以細胞濃度0.2-1x105/ml將細胞懸浮在生長培養基中。

2.從A-1或A-2制備的病毒結合板中去除洗滌液。不要讓板干燥。立即加入密度為0.5-2.5x 104/cm2的靶細胞。雖然最佳細胞密度取決于細胞大小和生長速率，但初始細胞密度還是應使細胞轉導后2-3天分析時能夠積極生長或接近匯合。當感染更多細胞時，可能會增加細胞密度，但細胞在基因轉導后需要傳代培養。 

3.在37℃、5% CO2的培養箱中孵育2-3天。

4.收集非貼壁和貼壁細胞:

（1）將上清液轉移到離心管中。

（2）用PBS洗滌培養板，收集剩余的非貼壁細胞。

（3）分離貼壁細胞。

（4）將步驟(1)-(3）中獲得的細胞混合在同一管中，離心回收細胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗滌細胞兩次，并通過離心收集。如果還需進行進一步分析，可將細胞在HBSS/Hepes溶液重懸（適用于細胞下游應用的任何緩沖液或培養基也可用于重懸）。

B.上清液感染方法

使用病毒原液時，推薦A方法，但如果稀釋4倍及以上，A、B方法都可以用，因為可獲得等效的基因轉導效率。此外，B方法感染病毒所需的時間比A方法短很多。

1.將靶細胞懸浮在已用生長培養基稀釋的病毒溶液中以制備細胞懸液。

2.將細胞懸液添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中，細胞密度為0.5-25×10⁴/cm²。雖然最佳細胞密度取決于細胞大小和生長速率，但在轉導后2-3天分析基因表達時，初始細胞密度應允許細胞積極生長或接近匯合。當感染更多細胞時，可能會增加細胞密度，但細胞在基因轉導后需要傳代培養。

3.在37℃、5% CO₂的培養箱中培養2-3天。

4.收集非貼壁和貼壁細胞:

（1）將上清液轉移到離心管中。

（2）用PBS洗滌培養板，收集剩余的非貼壁細胞。

（3）分離貼壁細胞。

（4）將步驟(1)-(3）中獲得的細胞混合在同一管中，離心回收細胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗滌細胞兩次，并通過離心收集。如果還需進行進一步分析，可將細胞在HBSS/Hepes溶液重懸（適用于細胞下游應用的任何緩沖液或培養基也可用于重懸）。

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